molecularkitten

เอ่อ..หง่า...ตามสัญญาอ่ะนะฮับ วันนี้มีวิธีทำ competent มาฝาก
แต่ไม่ใช่วิธีเทพนะฮะ เป็นวิธีที่พิเศษขึ้นมาหน่อย คล้าย CaCl₂
แหล่ะ แต่จะเพิ่มเกลืออีกตัวขึ้นมาคือ MgCl₂

เรื่องมีอยู่ว่า เจ้ากวางกับแตงโม เตรียม competent วิธี CaCl₂ แล้ว
ได้ efficiency น้อย อ.ปนัดดาเลยหาวิธีนี้มาให้ 'ลองทำดูสิคะ'
อาจารย์ว่ามางั้น แล้ว 2 ตัวนี่ทำแล้วก็ให้ efficiency เพิ่มกว่าปกติ
นิดหน่อย สรุปว่าดีขึ้นว่างั้น (แต่ก็ไม่เท่าวิธีเทพอ่ะนะ) ส่วนข้าพเจ้า
นั่น ได้ลองเอาวิธีนี้มาใช้สำหรับ ligation product อยากบอกว่าไม่ค่อย
เวิร์คเท่าไหร่แฮะ แต่เอามาใช้เตรียม competent สำหรับ express โปรตีน
แล้ว OK หง่ะ เลยใช้วิธีนี้มาตลอด (จริงๆคือ เสียดายนำยาที่เตรียมไว้ 555)

เลยเอามาแนะนำละกัน เผื่อใครที่เตรียม competent สำหรับ express
โปรตีน อย่าง BL21,C41,JM109 แล้วพบว่าป่วง (จริงๆ เรื่อง express นี่
efficiency ไม่เห็นต้องสนใจมากมายอ่ะ เอาแค่ขึ้นก็พอ แต่ก็มีคนเตรียม
ป่วงมาแล้วนะ!)

protocal นี้ ข้าพเจ้าแอบ adapt เอาเองเพื่อความสะดวกเด้อ

ของที่ต้องเตรียม

- 0.1M CaCl₂ solution
- 0.1 M MgCl₂ solution
- LB Broth
- Glycerol
 
วิธีเตรียม

1. steak เชื้อ ให้ได้ single colony (เชื้อที่สดใหม่ ไม่ควร incubate เกิน 12 hr.

2. เย็นวันถัดมา pick มา 1 colony ลงเชื้อใน LB broth (NO Amp นะเฟ้ยยย!!!!)
    3 ml แล้วก็ incubate ไว้ overnight  ที่ 37C แต่ห้ามเกิน 12 hr. (ลงเชื้อเพื่อ
    เป็น startor นั่นเอง)

3. เช้าวันต่อมา ดูดเชื้อจากเมื่อวานมา 1 ml ใส่ลงใน LB Broth 50 ml เอาไปเขย่า
    ที่ 37 C จน OD₆₀₀ ขึ้นไป 0.3-0.4 ขั้นตอนนี้ OD ห้ามเกินเด็ดขาด!!!!! 
    ถ้าเกินแปลว่าเชื้อแก่เกินแกงแล้ว ผนังเซลล์อาจรับ plasmid ได้ไม่ดีตอนใช้ 
    แต่ทั้งนี้ทั้งนั้นค่า OD ที่จะขึ้นไปถึง mid log phase อาจจะต่างกันตามชนิด, 
    strain ที่ใช้ด้วย ให้ศึกษา paper มาก่อนทำ! แต่ส่วนใหญ่มักจะอยู่ประมาณนี้

4. พอเชื้อได้ที่แล้ว ก็แบ่งเชื้อเป็น 2 tube  tube ละ 25 ml จุ่มแช่น้ำแข็งไว้สัก
    10 นาที

5. เอาเซลล์ไปปั่นที่ 4,000 rpm (ลองเช็คกับเครื่องปั่นเอาเองเด้อ อย่าให้ค่า
    rpm มันเกินนี้) 10 นาที และต้องเย็นด้วย! (4C)

6. เท media ทิ้ง ให้ออกหมดที่สุด จากนั้นกลับ tube เอา tube ตบกับฝ่ามือเบาๆ
    ให้ packed cells มันกระฉอกออกจากก้น tube จน packed cells คลายตัว
    ไม่จับเป็นก้อน ----> นี่คือเทคนิคในการ resuspend cell โดยไม่ต้องไปใช้ 
    pipette ไปกระซวกๆๆๆๆๆ ขึ้นๆลงๆ อย่าลืมว่าตอนนี้เซลล์มันบอบบางมาก
    นะฮะ ทำอะไรกับมันต้องเบาไม้เบามือหน่อย เดี๋ยวตายพอดี แล้วด้วยแรงเหวี่ยง
    เบาแค่ 4,000 rpm แค่นี้ ไม่ทำให้ packed cells มันแน่นขนาดต้องเอา pipette
   ไปกระซวกหรอกตบเบาๆหลายๆทีก็ออกมาหมดแล้ว

7. จากนั้นก็เท 0.1 M MgCl₂ ลงไปล้างเซลล์ 10 ml เราก็แอบเขย่าเบาๆ เล็กน้อย
    ให้เซลล์มันกระจายทั่ว solution แล้วก็วางไว้บนน้ำแข็ง 10 นาที

8. ปั่นเหมือนข้อ 6

9. เท solution ทิ้ง ปั่นล้างอีกรอบเหมือนข้อ 7 ด้วย 0.1M MgCl₂

10. พอปั่นล้างเสร็จ เหลือแต่ packed cell แล้ว  ก็ทำเหมือนเดิมคือ ตบกับฝ่ามือเบาๆ
       จน packed cells คลายตัว จากนั้นก็เติม 0.1M CaCl₂ ไป tube ละ 1 ml (สรุป 2 ml
       CaCl₂ ต่อ bacteria culture 50 ml) เขย่า tube ให้เซลล์กับน้ำยาเป็นเนื้อเดียวกัน
       เขย่าในน้ำแข็งด้วยนะ (คือ โกยน้ำแข็งให้มันเป็นหลุม แล้วเอา tube ไปเขย่า
       ในหลุมนั้นน่ะ) จากนั้นก็ pool เซลล 2 tube รวมกัน ให้เป็น 2 ml

11. จากนั้นดูด glycerol มา 900 ul เวลาดูดของหนืดให้ดูดช้าๆ จนแน่ใจว่ามัน
       ขึ้นมาครบแล้วจากนั้นก็ค่อยๆปล่อยให้ Glycerol หยดลงใน 2 ml cells
      ไปทีละนิด ทีละนิด มือหนึ่งกด pipette มือหนึ่งจับ tube cell เขย่าในน้ำแข็ง
      ไปด้วย เพื่อให้ glycerol เป็นเนื้อเดียวกับเซลล์เร็วๆ (final concentration ของ Glycerol
       ในเซลล์ คือ 30%) พอปล่อย glycerol หมดแล้ว ให้เอา pipette ลงไปดูดขึ้นดูดลง...
        เบาๆ...ตบท้ายสัก 3-4 ที เพื่อให้แน่ใจว่าเป็นเนื้อเดียวกันจริงๆ

12. aliquots เซลล์....ตามใจชอบ ของเราแค่ tube ละ 100 ul ก็เหลือแหล่แล้ว เวลา
       transform ดูดมาแค่ 50 ul เอามา spread plate   colony ก็ขึ้นบานเบอะแล้วน้อ
       จากนั้นก็รีบเอาเซลล์โยนเข้า -70 Cโดยด่วน อย่าพิรี้พิไรเด้อ

       สำหรับผู้ที่เตรียมวิธีนี้แล้ว ยังไม่ช่วยอะไร ให้รอพบกับวิธีเทพได้เร็วๆนี้(มั้ง)

Note

- เคล็ดลับการเตรียม competent คือ เชื้อ fresh, OD ไม่เกิน, เย็น, เร็ว, เบา(มือ)
  ฉะนั้นเซลล์ควรอยู่บนน้ำแข็งตลอดเวลา

- ไอ้ที่บอก on ice ก่อนสัก 10 นาทีก่อนค่อยปั่น ข้าพเจ้าไม่ค่อยจะอะไรมากเท่าไหร่นะ
   คือ ก็รีบทำรีบปั่นหน่ะ ไม่อยากให้เซลล์อยู่ข้างนอกนาน กว่าจะวิ่งไปเครื่องปั่น วิ่งไป
   hood กว่าจะ balance ก็จะครบ 10 min ไปเองแล้ว

- ปกติก็เตรียมใน hood เพื่อความสะอาด แต่คิดว่าไม่ต้องถึงขึ้นเอาเครื่องชั่งเข้า hood
   เพื่อจะ balance tube ก่อนปั่นหรอกนะ บางคนเข้าเตรียมกันนอก hood ด้วยซ้ำ ก็ไม่เห็น
  ว่ามันจะ contaminate นะ เพราะ hood ไม่ได้ไว้ให้เอาของไม่สะอาดเข้าไปนะคะ จะใช้
  hood ก็เอาเฉพาะที่จำเป็นเข้าไปเท่านั้น ยิ่งเอาเข้าไปมาก โอกาส contaminate ก็มากเน้อ
  (เรา balance มันข้างนอก หน้าเครื่องปั่นนั่นหล่ะ)

- เก็บ competent ไว้ในกล่องที่ไม่เปิดบ่อย หรืออยู่ก้นตู้เลยได้จะยิ่งดี

ปล. นินทาสักหน่อย เร็วๆนี้เชี้ยยะเตรียม competent หล่ะ อุตส่าห์เตรียมวิธีเทพ 
      ใช้ DMSO ผลออกมา....ได้ 10⁵  แล้วจะใช้ DMSO เพื่อ...... -_- (ของเทวาน่ะ
      เค้าทำแล้วได้อย่างต่ำ 10⁸ นะยะ เทพสมชื่อ....) อ่อนค่ะ...อ่อนมว๊ากกกกก
      มีแต่ปริมาณ ไร้ซึ่งคุณภาพก็เงี้ยแหล่ะค่ะ โฮะๆๆๆๆๆๆๆ

edit @ 12 Dec 2007 22:52:58 by molecularkitten